Ursprünglich diente das Gebäude ab der Mitte des 15. Jahrhunderts als Sitz der Büros (ital. uffici) der Stadtverwaltung. Der Auftrag, wichtige Verwaltungsinstitutionen in einem Bau zusammenzufassen, geht auf Cosimo I. de’ Medici, Großherzog der Toskana, zurück. Zwischen 1559 und 1581 wurde der Gebäudekomplex dann durch die Architekten Vasari, Buontalenti und Parigi den Jüngeren erbaut.Schon bald war die von Cosimos Erbe, Francesco de’ Medici verwaltete Kunstsammlung Teil der Uffizien. Ab 1789 wurde die seit Beginn im Gebäude beheimatete Kunstsammlung der Medici auch für die Öffentlichkeit zugänglich gemacht. Einige Kunsthistoriker halten die Galerien der Uffizien deshalb für das erste Museum in Europa.Als die Dynastie der Medici schließlich unterging, vermachte die einst mächtige Familie ihre Kunstschätze unter der Bedingung, dass sie ihren Standort niemals verlassen dürften, der Stadt Florenz.